①支原体检测

     主细胞库、工作细胞库、病毒种子批、对照细 胞以及临床治疗用细胞进行支原体检查时,应同时 进行培养法和指示细胞培养法(DNA染色法)。病毒类 疫苗的病毒收获液、原液采 用培养法检查支原体,必要时,亦可采 用指示细胞培养法筛选培养基;也可采 用经国家药品检定机构认可的其他方法。

    a. qPCR 法

     采用qPCR荧光探针法,通过特异性引物、探针(FAM标记)扩增检 测支原体基因组中16S rRNA编码区,定性检 测样本中支原体DNA,涵盖了120多种支原体DNA序列;检测快速,专一性强,性能可靠,参照EP 2.6.7和JP XVII支原体 检测相关要求进行验证;用于主细胞库、工作细胞库、病毒种 子库以及临床治疗用细胞的检测。
内部质控(IC,VIC标记)可在PCR扩增反应阶段加入,以判断 待检样本对扩增反应是否存在抑制,防止假 阴性结果的产生;也可在 样本提取阶段加入,以评估提取效果。
采用磁 珠法提取纯化支原体DNA,高效提 取样本中的支原体DNA,确保检测限可达到10 CFU/ml。
    NAT测试系统要求
        – 作为培 养法的替代方法:NAT测试系统必须检测到10CFU/mL
        – 作为指 示细胞培养法的替代方法:NAT测试系统必须检测到100CFU/mL
        – 内部质控IC(整个过程:提取、逆转录、扩增、检测)
        – 外部质控(PC、NTC、NCS)

质控结果分析

Ct-PC

Ct-NTC

Ct-NCS

FAM

VIC

FAM

VIC

FAM

VIC

<40

<40

Ct40或无扩增

<40

Ct40或无扩增

<40

待测样 本检测结果分析

FAM

VIC

结果判断

Ct<40

<40

阳性

Ct40或无扩增

有抑制

Ct40或无扩增

Ct<40

阴性

Ct40或无扩增

有抑制


    b.培养法

    每支培 养基接种供试品0.5ml-1.0ml,于特定环境下培养28天后观 察培养基的变化,与阴阳 性对照培养基作比较。
培养基的选择:支原体肉汤培养基,精氨酸 支原体肉汤培养基,支原体 肉汤半流体培养基(支原体 肉汤琼脂培养基),精氨酸支原体 肉汤半流体培养基(精氨酸支原体 肉汤琼脂培养基),选取液 体和半流体培养基或者液体和固体的培养基用于支原体的检查。亦可使用其他培养基,但灵敏 度必须符合要求。
培养基灵敏度检查(变色单位试验法):(1)菌株肺炎支原体(ATCC15531株)、口腔支原体(23714株,)由国家检定机构分发。灵敏度为10cfu/ml,是药典 上最普遍的方法,不过检测时间过长,操作过程也繁琐,结果判 定的有一定的人为因素。


    c.指示细胞法

   将供试 品接于指示细胞(无污染的Vero细胞或 经国家药品检定机构认可的其他细胞)中培养后,用特异荧光染料染色。如供试品污染支原体,在荧光 显微镜下可见附在细胞表面的支原体DAN着色。灵敏度为100cfu/ml,中国药 典检测支原体的另一种方法,时间大约也需要20天,容易污染,结果判 定有也一定的人为因素。
结果判定:
    ⑴ 阴性对照:仅见指 示细胞的细胞核呈现黄绿色荧光。
    ⑵ 阳性对照:荧光显 微镜下除细胞外,可见大小不等、不规则 的荧光着色颗粒。
    当阴性 及阳性对照结果均成立时,试验有效。



    d.法规

     EP9.0-2.6.7.支原体/JP17-支原体

    ②无菌检测

    无菌检 查法系用于检查药典要求的无菌的药品、生物制品、医疗器具、原料、辅料及 其他品种是否无菌的一种方法。





    ③分枝杆菌检测

    ④病毒检测

     用哺乳 类工程细胞生产的产品,包括临 床治疗用细胞制品,根据ICH相关指导原则,不确定 的病毒污染是一项重要的安全考量,可用in vitro方法来检测。SHENTEK可为细胞库,种子库,原材料和终产品提供in virto检测和 客户定制化检测。
     In-vitro方法检 测内源或不确定的病毒。




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